免疫检查点抑制剂（ICIs）在癌症治疗中取得了显著的突破，为晚期疾病患者提供了持久的生存益处。作为一种关键的治疗方法，新辅助治疗旨在通过全身治疗在手术前控制肿瘤，从而减少术后复发和转移，同时提高总生存期（OS）和无病生存期（DFS）。新型ICIs的出现，包括nivolumab、atezolizumab、pembrolizumab和avelumab，显著扩大了治疗选择，为晚期膀胱癌患者带来了新的希望。然而，尽管取得了这些进展，肿瘤异质性和对ICIs的获得性耐药性仍然是限制治疗效果的重大挑战。解决这些挑战需要对膀胱癌异质性和针对个体患者特征的精准联合策略有更深入的了解。因此，阐明免疫治疗耐药性的分子机制对于推进更有效的治疗方法至关重要。

代谢重编程在肿瘤进展中发挥重要作用，而谷氨酸转运蛋白SLC1A6可能与肿瘤代谢和免疫治疗耐药性相关。在这项研究中，使用单细胞 RNA 测序分析确定 SLC1A6 是膀胱癌免疫治疗耐药的关键驱动因素。对公开可用的肺癌单细胞数据集以及来自膀胱癌和肺癌队列的转录组数据的分析进一步支持了其临床相关性。在体外和体内进行的功能测定提供了额外的证据，支持其在免疫逃避和治疗耐药性中的作用。我们的研究结果表明，靶向 SLC1A6 可能代表了提高癌症新辅助免疫治疗疗效的一种有前途的策略。

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1. 膀胱癌患者新辅助免疫治疗的单细胞RNA测序分析

为了探究与膀胱癌新辅助免疫治疗耐药性相关的因素，我们对接受了新辅助免疫治疗的8位膀胱癌患者进行了单细胞RNA测序分析，其中包括4例免疫治疗敏感病例和四例免疫治疗耐药病例（图1A）。经过严格的质量控制措施和标准单细胞分析流程，包括批次效应校正和降维，无监督聚类共识别出20个细胞簇。这些细胞簇根据典型的标志物被归类为八种主要的细胞类型：上皮细胞（肿瘤细胞）（EPCAM）、T细胞（CD3D, GZMB）、B细胞（CD79A, MS4A1）、浆细胞（JCHAIN）、髓系细胞（LYZ, CD68）、肥大细胞（TPSAB1）、成纤维细胞（FAP, COL1A1）和内皮细胞（VWF）（图1B）。值得注意的是，免疫治疗耐药患者中的细胞群主要由肿瘤细胞组成，而T细胞亚群在术前新辅助免疫治疗耐药组中的比例有所降低（图1C, D）。用于注释细胞亚群的标志性分子如图1E。

2. SLC1A6与膀胱癌免疫治疗耐药性相关

为了进一步鉴定与膀胱癌新辅助免疫治疗耐药性相关的关键分子，我们对上皮细胞进行了重新聚类，共识别出七个不同的肿瘤亚簇（图2A）。比较治疗耐药组和治疗敏感组亚簇的组成发现，肿瘤c7亚簇在耐药组中特异性富集（图2B）。图2C展示了定义每个肿瘤亚簇的关键标志基因。随后，我们对敏感组和耐药组肿瘤细胞进行了差异表达分析。在耐药组中显著上调的基因中，SLC1A6被鉴定出来。值得注意的是，SLC1A6特异性地在肿瘤c7亚簇中表达，该亚簇在免疫治疗耐药组中特异性富集（图2D）。肿瘤c7亚簇中差异表达基因的GSEA显示，与其他亚簇相比，免疫激活通路下调（图2E）。综合这些发现表明，SLC1A6与膀胱癌新辅助免疫治疗耐药性相关。

3. SLC1A6表达与膀胱癌进展和免疫浸润的相关性

为了进一步评估SLC1A6在膀胱癌中的临床意义，我们从TCGA数据库收集并分析了数据。我们的发现表明，SLC1A6在肿瘤组织中的表达显著高于正常组织（图3A）。此外，我们比较了膀胱癌患者不同病理T和N阶段SLC1A6的表达水平，并观察到SLC1A6表达与晚期病理T和N阶段呈正相关，更高的表达水平与疾病进展相关（图3B, C）。接下来，我们根据表达水平将膀胱癌患者分为SLC1A6低表达组和SLC1A6高表达组。生存分析显示，SLC1A6低表达组的患者预后优于SLC1A6高表达组的患者（图3D）。GSEA进一步揭示，SLC1A6低表达与免疫激活通路相关（图3E, F）。然后，我们应用CIBERSORT、ESTIMATE和ssGSEA算法评估两组的免疫浸润（图3G, H）。结果显示，SLC1A6低表达组表现出更高的免疫浸润评分和ESTIMATE评分，表明免疫浸润增强和肿瘤纯度降低。此外，SLC1A6低表达组表现出免疫细胞浸润增加，尤其是具有抗肿瘤活性的免疫细胞，如T细胞（包括辅助T细胞和细胞毒性T细胞）和自然杀伤（NK）细胞。综合这些发现表明，SLC1A6与肿瘤进展和免疫抑制性肿瘤微环境的形成相关。

4. 肿瘤细胞中的SLC1A6竞争性摄取谷氨酸以降低CD8+ T细胞的效应功能

基于我们之前的分析，我们采用了体外共培养模型来验证肿瘤细胞中SLC1A6表达对T细胞效应功能的影响。首先，我们在小鼠膀胱癌细胞系MB49中敲低了SLC1A6。接下来，我们测量了MB49 shNC和MB49 shSLC1A6细胞及其培养上清中的谷氨酸水平。MB49 shSLC1A6细胞中的谷氨酸含量降低，而上清中的谷氨酸水平增加（图4A, B）。这些结果表明，肿瘤细胞的SLC1A6通过促进外源性谷氨酸的摄取，增强了肿瘤细胞的生长和迁移能力。我们推测谷氨酸可能影响T细胞的效应功能。流式细胞术分析显示，添加外源性谷氨酸增加了GZMB + CD8 + T细胞的比例（图4C, D）。接下来，我们分别将MB49 shNC和MB49 shSLC1A6细胞的条件培养基添加到原代小鼠T细胞中。流式细胞术分析揭示，与MB49 shNC组相比，MB49 shSLC1A6组中GZMB + CD8 + T细胞的比例更高。此外，向MB49 shNC条件培养基中添加谷氨酸增加了GZMB + CD8 + T细胞的比例（图4E, F）。上述结果表明，肿瘤细胞的SLC1A6通过竞争性摄取谷氨酸，降低了CD8 + T细胞的效应功能，而外源性谷氨酸的补充和肿瘤细胞中SLC1A6表达的降低均增强了CD8 + T细胞的效应功能。

5. MB49细胞中SLC1A6的敲低增强了抗-PD-1免疫疗法的疗效

为了探究SLC1A6敲低对抗-PD-1免疫疗法的影响，我们建立了MB49细胞的皮下肿瘤模型。小鼠被注射了MB49 shNC或MB49 shSLC1A6细胞，随后用抗-PD-1抗体或IgG作为对照进行治疗（图5A）。我们的结果显示，SLC1A6敲低在一定程度上抑制了肿瘤生长。虽然单独的抗-PD-1疗法在MB49肿瘤模型中表现出部分疗效，但SLC1A6敲低与抗-PD-1治疗的结合显著增强了肿瘤的抑制。在LLC小鼠模型中SLC1A6的敲低显著增强了抗-PD-L1的疗效。总之，靶向SLC1A6的抑制与免疫检查点抑制协同作用，如改善的治疗反应指标得到了证明。

除了在中枢神经系统中作为神经递质的经典作用外，谷氨酸已成为免疫反应和肿瘤免疫治疗的关键调节因子。尽管已经开发了针对谷氨酸代谢、其转运蛋白和相关信号通路的靶向治疗药物，但它们在癌症患者中的临床疗效仍有待完全阐明。随着我们对谷氨酸信号传导及其与肿瘤细胞和CD8⁺T细胞的相互作用的理解不断深入，靶向调节谷氨酸代谢可能为增强肿瘤免疫治疗和改善患者预后提供新的策略。

在这项研究中，我们使用单细胞RNA测序分析确定了谷氨酸转运蛋白SLC1A6是膀胱癌免疫治疗耐药性的关键介质。使用肺癌单细胞数据集以及膀胱癌和肺癌队列的转录组数据进一步验证了SLC1A6的临床意义，随后通过体外和体内功能实验，证实了其在促进癌症新辅助免疫治疗耐药性中的作用。据报道，SLC1A6表达的降低与免疫细胞浸润增加和对免疫检查点阻断治疗的敏感性提高相关，这与我们的观察结果一致。未来的研究需要涉及更广泛的癌症类型，以确定SLC1A6的免疫调节作用是否在恶性肿瘤中保持一致。在精准肿瘤学的背景下，未来的努力应继续集中在开发和系统评估针对SLC1A6的治疗策略，特别关注其在不同、真实世界临床环境中的疗效和安全性。

总之，我们的研究确定了SLC1A6作为癌症中的新型生物标志物和潜在治疗靶点，为其预后意义提供了宝贵的见解。靶向SLC1A6可能为克服新辅助免疫治疗耐药性提供一种有希望的策略，并促进联合治疗方法的发展，最终改善癌症的治疗效果。

参考文献：Li C, Lin Y, Zheng H, Zeng H, Xu L, Wu D, Lao J, Cai P, Liang S, Wang C, Lin T, Zhong W. Glutamate transporter SLC1A6 promotes resistance to immunotherapy in cancer. Cancer Immunol Immunother. 2025 Jun 7;74(8):240. doi: 10.1007/s00262-025-04074-4. PMID: 40481876; PMCID: PMC12145344.

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