抗体捕获神器,轻松搞定IP/COIP
——Protein A /G 琼脂糖或磁珠
Protein A、Protein G是最常应用于抗体亲和纯化和免疫沉淀的蛋白。 Protein A/G琼脂糖或磁珠将Protein A、G共价偶联到介质表面,具有结合能力更强、结合范围更广、实用性更高的特点。
Protein A/G 4FF Agarose |
Protein A/G MagBeads |
|
基质 |
高度交联4%琼脂糖微球 |
聚合物磁性微球 |
填料粒径 |
45-165 µm |
1 µm |
载量 |
>20 mg 人IgG/mL |
>50 µg 人IgG/mg |
优势 |
简单易用,无需辅助设备 |
操作简单 |
孔径大,结合力强 |
直径小,动力学好 |
|
靶蛋白获取量高 |
表面光滑,beads吸附很少,背景低,抗体消耗少 |
|
缺点 |
多孔易吸附(需要做pre-clear) |
配套磁力架使用方便 |
1、纯化抗体:一步纯化即可从血清或腹水样品中分离出高纯度的抗体。
2、免疫沉淀(immunoprecipitation,IP):通过对某蛋白质的富集,研究该蛋白的特性(如翻译后修饰等)。
3、免疫共沉淀Co-IP(co-Immunoprecipitation):通过对某蛋白质的富集,研究与其结合的其他蛋白(即蛋白-蛋白相互作用、蛋白复合物等)。
1、Protein A/G 4FF Agarose纯化兔血清中的抗体。
图1 Protein A/G 4FF Agarose纯化抗体结果电泳图
2、整个实验设计中,为了进一步阐明Atuveciclib在IL-1b诱导的基质降解中的作用。研究人员在IL-1b刺激30 min前,先利用Atuveciclib预处理人和大鼠NP细胞2h,然后使用针对p65和细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)的特异性抗体对提取的总细胞蛋白进行免疫沉淀分析。结果发现, IL-1b刺激增强了p65和CDK9之间的相互作用,而Atuveciclib减弱了这种作用。
Fig 2. Immunoprecipitants were then subjected to western blot analysis using specific antibodies against CDK9 and p65.
1、Co-IP背景较深或者条带杂乱
● 固相基质的非特异性结合
● 抗体结合非特异的蛋白
● 洗涤不当造成杂带
● 建议方案:pre clear或者更换磁珠;设置对照排除非特异性条带;优化缓冲液
2、Input条带清晰,co-IP条带很弱?
设X为诱饵蛋白,Y为靶蛋白,有可能为
● X和Y的相互作用本身比较弱
● X蛋白并不是Y的唯一,只部分Y与X互作
● 可以尝试反向拉,比如用Y去拉X,可能效果比较好
3、我的蛋白正好和抗体重链分子量接近,要如何减少抗体干扰?
● IP/WB一抗使用不同种属来源,选择与IP抗体种属无交叉反应的二抗(Cross Adsorbed secondary antibody)
● 特殊二抗:比如仅识别重链或者轻链的二抗,或者仅识别天然抗体的二抗
● 直接源头遏制:将抗体直接交联到bead上,或者将抗体交联到protein A/G上,避免洗脱干扰
4、靶蛋白没有条带
● 裂解液不合适,或者没有添加抑制剂,导致靶蛋白或者饵蛋白构象改变不能结合或者降解
● 饵蛋白较难洗脱,换成高强度的洗脱缓冲液
● 选用的抗体不合适,建议IP验证过的抗体,并优化下抗体用量
● 蛋白间为弱相互作用,或者相互作用依赖翻译后修饰
5、琼脂糖难离心,每次总会吸上来一点儿
● 使用带滤膜的离心柱,下部有接样管,琼脂糖完全截留在滤膜上
● 换成磁珠
6、我的目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀
● 若此蛋白带标签,可选择针对此蛋白的标签抗体来进行免疫沉淀。
产品名称 |
货号 |
规格(mL) |
价格(元) |
36403ES03/05/08/25/60 |
1/2/5/25/100 |
278/538/878/2886/7426 |
|
36404ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
978/3186/8726 |
|
36417ES03/08 |
1/5 |
787/2937 |
产品名称 |
货号 |
规格(mL) |
价格(元) |
36401ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
546/2186/7426 |
|
36402ES08/25/60 |
5 /25 /100 |
866/2656/8856 |
|
36403ES03/05/08/25/60 |
1/2/5/25/100 |
278/538/878/2886/7426
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